얇은막 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography) 결과 레포트

 

안녕하세요, 화학을 전공한 공돌이입니다. 오늘은 얇은막 크로마토그래피 결과 레포트에 대해서 포스팅 합니다. 아래 결과 레포트 참고하셔서 얇은막 크로마토그래피 레포트 작성하실 때 좋은 참고 자료가 되었으면 합니다.

 

 

■ 실험 목적

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1) 크로마토그래피의 기본적인 원리를 이해하고, 혼합물의 분리를 통해 유기화합물의 분리 원리를 알아본다.

2) 얇은막 크로마토그래피의 원리를 이해하고, 그 사용 방법을 연습한다.

3) 얇은막 크로마토그래피를 이용하여 이성질체를 분리하고 Rf를 확인한다.

 

 

■ 크로마토그래피의 배경, 용도 및 원리

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 1) 크로마토그래피 배경

약어는 TLC이며, 1951년에 J. 키르치너의 크로마토 스트립(chromato strip)법에서 발단하여 1956년 독일의 E. 슈탈에 의해 일반화되었다. 흡착제로는 사용 목적에 따라 실리카겔, 산화 알루미늄, 섬유소말 이온, 셀룰로오스 등이 쓰인다. 이 방법은 여과지 크로마토그래피에 비해 전개시간이 짧고(30~60분) 분리능률이 양호하며, 강한 산, 강한 염기나 강렬한 시약 등을 시약으로 사용할 수 있는 특징을 지니고 있다. 유기 화합물의 분리, 정제, 정량, 순도 검정, 반응이나 대사과정의 추적, 무기이온 분석 등 응용 범위가 굉장히 넓기에 매우 유용한 실험 방법이다.

 

2) 크로마토그래피 용도

크로마토그래피는 많은 과학 분야에서 이용되는 분석법으로서 소량으로 화합물을 확인하고, 많은 종류로 구성된 혼합물을 분리하는데 사용된다. 식물학자 ‘믹카이 티스위트’가 여러 식물성 색소의 혼합 용액을 탄산칼슘을 채운 유리관을 통해 분리하였다. 분리된 화학종은 색을 가진 띠로 나타났는데, 이것이 바로 크로마토그래피(Chromatography)이다.

 

3) 크로마토그래피 원리

크로마토그래피는 상 분배 원칙에 근거하여 정지상(Stationary phase)과 이동상(Mobile phase) 사이의 물질의 분배를 수반한다. 우리가 금일 실험에 사용했던 얇은 막 크로마토그래피는 유리판 위에 실리카 겔이나, 알루미나 가루를 이용하여 만든 크로마토그래피이다. 정지상(고체)은 실리카 겔 층이고 전개 용매는 이동상(액체)이다. 분석할 물질들은 ‘모세관 현상’에 의해 전개되는데 이 때 실리카 겔 층과 분석 물질, 전개 용매와 분석 물질의 상호작용에 의해 선택적으로 흡착된다.

 

일반적으로 정지상(실리카 겔, 알루미나)은 강한 극성을 띠므로 실리카 겔은 강한 극성물질일수록 잘 흡착한다. 즉 흡착이 잘 되어 상대적으로 조금 이동한다. 약한 극성을 띠거나 비극성 물질에 대해서는 덜 흡착되어 상대적으로 멀리 이동한다. 얇은 층 크로마토그래피에서도 강한 극성을 띄는 물질일수록 실리카 겔 층에 잘 흡착되기 때문에 전개 용매가 이동하는 동안 상대적으로 느리게 이동하여 얇은 막 크래마토그래피 판 아래쪽에 흡착 되고, 극성이 약한 물질은 실리카 겔 층과 덜 흡착되기 때문에 위쪽에 나타나게 된다.

 

 

■ 실험기구 및 시약

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실험 기구 : UV-lamp, Vial, 실린더, 모세관, 스포이드, 핀셋, 작두, 커터칼, 눈금자, 마스크, 실험용 장갑, 보안경, 연필

시약 : 전개용매 (Ethyl acetate, Hexane), stilbene isomer(스틸벤 이성질체), nitrophenol isomer(나이트로페놀 이성질체)

 

 

■ 실험 방법

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1) TLC 판을 가로 1.3cm, 세로 5cm로 자른다. 위, 아래 여백 0.5cm씩 연필로 선을 그어 둔다.

2) 전개용매(Ethyl Acetate, Hexane), 모세관, 시료, vial(20mL) 11개를 준비한다.

3) 5개의 vial은 다양한 비율로 혼합된 전개 용매 용기로 사용하고, 5개는 TLC를 전개 시킬 chamber로 준비한다. (Ethyl Acetate : Hexane = 5:1 ~ 1:5 까지 변경하여 극성 조절) 1개는 모세관을 담는 통으로 사용한다.

4) Stilbene을 methylene chloride로 녹인 후 모세관을 이용하여 아래쪽 선에 spot을 찍는다. (2개의 시료를 하나의 TLC 기판에 찍음)

5) Spotting한 TLC 판을 전개 용매가 담긴 vial에 넣고 뚜껑을 닫은 후 위 쪽 표시선까지 전개시킨다. 각각의 Rf를 계산하고 cis와 trans 이성질체로 구분한다. (UV lamp를 이용하여 연필로 표시)

6) Nitrophenol 4번과 같이 준비한 후, 전개시켜 ortho와 para 이성질체를 구분한다.

7) Nitrophenol에 대하여 다양한 용매조건으로 시험하고, 각 실험별 Rf를 구한다.

8) Nitrophenol isomer를 효과적으로 분리할 수 있는 전개 용매 조건을 결정한다.

 

 

■ 실험 결과

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(1) EA : Hexane -스틸벤, Stilbene-

(2)MC : Hexane -스틸벤, Stilbene-

(3)EA : Hexane -나이트로 페놀, Nitropenol-

(4)MC : Hexane -나이트로 페놀, Nitropenol-

 

Stilbene과 Nitropenol의 각각의 이성질체(Stilbene은 Cis and Trans, Nitropenol은 Para and Ortho)가 서로 다른 극성을 가지므로 전개 용매를 통해 실험을 해보면 다른 Rf 값을 나타내게 된다. 우리는 이를 통해 각각의 이성질체를 분리할 수 있었다.

 

(1)번 실험의 경우, Stilbene은 EA : Hexane의 비율이 1:10 일 때, 가장 큰 Rf 값의 차이를 보였다.

(2)번 실험의 경우, Stilbene은 MC : Hexane의 비율이 1:30 일 때, 가장 큰 Rf 값의 차이를 보였다.

(3)번 실험의 경우, Nitropenol은 EA : Hexane의 비율이 1:4 일 때, 가장 큰 Rf 값의 차이를 보였다.

(4)번 실험의 경우, Nitropenol은 MC : Hexane의 비율이 3:1 일 때, 가장 큰 Rf 값의 차이를 보였다.

 

-> Stilbene의 경우, 최적의 전개 용매에서 A=Trans Isomer, B=Cis Isomer이다. 또한Nitrophenol의 경우, 최적의 전개 용매에서 A=Para Isomer이고, B가 Ortho Isomer이다.

그 이유는 아래 고찰에 나타내겠다.

 

■ 고찰

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우리의 실험 목적은 Stilbene과 Nitropenol 각각의 이성질체를 분리하는 것이다. Stilbene의 경우 EA : Hexane의 비율이 1:10 일 때가 최적 용매 조건이다. 최적 용매 조건인 이유는 Rf값이 가장 큰 차이를 보여서인데, Rf값의 차이가 크다는 것은 그만큼 이성질체끼리 잘 분리 되었다는 것이기 때문이다. 비극성인 Hexane의 비율을 더 크게 했을 때 A의 전개 거리가 더 크다는 것은 A가 비극성임을 알게 해 준다. 따라서 B는 A보다 극성이 크다는 것도 알 수 있다.

 

Stilbene은 최적 용매 조건에서 Trans, Cis Isomer가 존재한다. 그러나 Stilbene은 일반적인 물질의 성질과는 다르게 Trans Isomer가 Cis Isomer보다 더 극성을 띈다. 그 이유는 Stilbene이 콘주게이션을 통한 공명 구조로 이루어져 있기 때문이다. Nitropenol의 경우 MC : Hexane의 비율이 3:1 일 때가 최적 용매 조건이다. 이 역시 Rf값의 차이가 가장 크게 나타났기 때문이다. 이 실험에서는 극성인 MC의 비율을 더 크게 하였는데, A의 전개 거리가 더 크다는 것은 A가 B보다 더 극성이 크다는 것을 의미한다. Nitropenol은 극성인 Para Isomer, 극성이 약한 Ortho Isomer가 존재한다. 즉, 우리는 실험을 통해 A가 Para Isomer, B가 Ortho Isomer임을 알 수 있었다.

 

몇 가지 주의사항으로는 TLC 전개 시 반드시 Vial 뚜껑을 닫아야 하는데 그 이유는 전개 용매가 휘발성을 가지고 있어 뚜껑을 닫지 않으면 전개 용매가 공기 중으로 날아가 버려 제대로 된 실험값을 측정할 수 없기 때문이다. 또한 새 실험을 할 땐 모세관에 여러 혼합물이 혼합 되어 있으므로, 이를 세척하기 위해 MC나 EA로 모세관을 세척해 주는 것이 좋다.

 

마지막으로 전개 용매에 TLC 종이를 넣을 때, 전개 용매가 실리카 겔 선보다 밑으로 오게 해 주어야 하는데, 전개 용매가 실리카 겔 선을 덮을 시, Stilbene이나 Nitropenol이 뒤엉켜 뭉쳐서 올라가기 때문에 정확한 실험값을 측정하는데 어려움이 생기기 때문이다.