컬럼 크로마토그래피(Column Chromatography) 결과 레포트

안녕하세요, 고분자 중합실험 결과레포트를 공유해 드리는 화학을 전공한 공돌이입니다. 오늘은 고분자 중합실험 중 컬럼 크로마토그래피 결과 레포트를 포스팅 해볼까 합니다. 제가 포스팅한 결과 레포트를 100% 베끼게 되면 결코 컬럼 크로마토그래피 실험 결과를 자기 것으로 만들 수 없으니 적당히 참고만 하시는 것을 권장드립니다.

 

 

■ 컬럼 크로마토그래피(Column Chromatography)의 실험 목적

---

1) 컬럼 크로마토그래피의 사용 방법을 익히고, 이를 통해 유기 혼합물의 분리 방법을 이해한다.

2) 컬럼 크로마토그래피를 통해 나이트로 페놀(Nitrophenol)의 이성질체(Ortho-Isomer, Para-Isomer)를 분리하고, 유기 분자의 극성과 전개 용매, 고정상과의 상관관계를 이해한다.

3) 컬럼 크로마토그래피를 통해 분리된 Nitrophenol의 이성질체의 순도 및 수득량을 확인한다.

 

 

■ 컬럼 크로마토그래피의 배경, 용도 및 원리

---

1) 컬럼 크로마토그래피 배경

1951년에 J. 키르치너의 크로마토 스트립(chromato strip)법에서 발단하여 1956년 독일의 E. 슈탈에 의해 일반화되었다. 흡착제로는 사용 목적에 따라 실리카겔, 산화 알루미늄, 섬유소말 이온, 셀룰로오스 등이 쓰인다. 이 방법은 여과지 크로마토그래피에 비해 전개시간이 짧고(30~60분) 분리능률이 양호하며, 강한 산, 강한 염기나 강렬한 시약 등을 시약으로 사용할 수 있는 특징을 지니고 있다. 유기 화합물의 분리, 정제, 정량, 순도 검정, 반응이나 대사과정의 추적, 무기이온 분석 등 응용 범위가 굉장히 넓기에 매우 유용한 실험 방법이다.

 

2) 컬럼 크로마토그래피 용도

크로마토그래피는 많은 과학 분야에서 이용되는 분석법으로서 소량으로 화합물을 확인하고, 많은 종류로 구성된 혼합물을 분리하는데 사용된다. 식물학자 ‘믹카이 티스위트’가 여러 식물성 색소의 혼합 용액을 탄산칼슘을 채운 유리관을 통해 분리하였다. 분리된 화학종은 색을 가진 띠로 나타났는데, 이것이 바로 크로마토그래피(Chromatography)이다.

 

3) 컬럼 크로마토그래피 원리

크로마토그래피는 상 분배 원칙에 근거하여 정지상(Stationary phase)과 이동상(Mobile phase) 사이의 물질의 분배를 수반한다. 우리가 금일 실험에 사용했던 얇은 막 크로마토그래피는 유리판 위에 실리카 겔(Silica gel)이나, 알루미나 가루를 이용하여 만든 크로마토그래피이다. 정지상(고체)은 실리카 겔 층이고 전개 용매는 이동상(액체)이다. 분석할 물질들은 ‘모세관 현상’에 의해 전개되는데 이 때 실리카 겔 층과 분석 물질, 전개 용매와 분석 물질의 상호작용에 의해 선택적으로 흡착된다.

 

일반적으로 정지상(실리카 겔, 알루미나)은 강한 극성을 띠므로 실리카 겔은 강한 극성물질일수록 잘 흡착한다. 즉 흡착이 잘 되어 상대적으로 조금 이동한다. 약한 극성을 띠거나 비극성 물질에 대해서는 덜 흡착되어 상대적으로 멀리 이동한다. 얇은 층 크로마토그래피에서도 강한 극성을 띄는 물질일수록 실리카 겔 층에 잘 흡착되기 때문에 전개 용매가 이동하는 동안 상대적으로 느리게 이동하여 얇은 막 크래마토그래피 판 아래쪽에 흡착 되고, 극성이 약한 물질은 실리카 겔 층과 덜 흡착되기 때문에 위쪽에 나타나게 된다.

 

 

■ 실험 기구 및 시약

---

1) 실험기구

TLC 판, TLC Chamber(20mL Vial) TLC 재단 도구, 모세관, UV-lamp, 컬럼, 1구 둥근 바닥 플라스크(100mL, 250mL), 깔대기, 삼각 플라스크, 실험용 장갑, 보안경, 펜, 핀셋, 작두, 눈금자, 실린더

 

2) 용매 및 시약

전개 용매(Ethylacetate, MC, Hexane), Nitrophenol Isomer 혼합물, Silica gel

 

 

■ 실험 방법

---

1) 전개 용매를 준비한다. 각 조에서 결정한 혼합 비로 준비하되, 용매가 증발되지 않도록 막아준다.)

-> 우리 조는 전개 용매 MC:Hexane을 3:1의 비율로 준비했다. 그 이유는 Nitrophenol의 이성질체를 분리하는 기존의 얇은 막 크로마토그래피 실험에서 위와 같은 비율을 사용하여 최적의 결과물을 얻었기 때문이다.

 

2) 컬럼관을 수직으로 장치하고, 긴 유리관을 이용하여 컬럼의 맨 밑을 솜으로 막고 Sea sand를 넣은 다음, 전개 용매를 100mL 정도 넣어 준다. (Sea sand가 패이지 않도록 주의한다.)

 

3) Silica gel(실리카 겔)을 전개 용매 또는 Hexane에 넣은 뒤 잘 저어주어 Silica gel slurry를 만든다. (기포를 제거함으로써 Packing이 잘 이루어지게 한다.)

 

4) 준비된 컬럼에 Silica gel slurry를 잘 저으면서 천천히 넣어준다.

 

5) 컬럼관을 밑에서부터 가볍게 두드리면서 충진 효율을 높이고, Stopcock을 열어주어 용매를 받아낸다.

 

6) Silica gel 표면 위로 5~10cm 정도 까지 용매를 제거하고, Silica gel 표면이 더 이상 내려가지 않는 것을 확인한 후, 흡착된 시료를 용매에 갠 후 천천히 넣어준다.

 

7) 흡착된 시료를 넣은 후 시료 표면이 약간 마르게 보일 때까지 용매를 받아낸 후, 컬럼의 Stopcock을 잠근다. 이후, 컬럼을 조금 세게 두드리면 Silica gel이 골고루 충진되면서 용매가 표면 위로 다시 나타난다. 그러면 다시 Stopcock을 열어 시료 표면이 약간 마르게 보일 때까지 용매를 받아낸 후 Stopcock을 잠근다. 이 과정을 2~3회 정도 반복한다.

 

8) Sea sand를 1cm 정도 천천히 넣은 후, 전개 용매를 컬럼에 천천히 주입하여 용리를 시작한다.

-> 컬럼 하고자 하는 불순물이 섞인 용액을 loading 할 때에 Sea sand를 까는 이유는 Silica gel의 packing을 균일하게 해야만 분리 하고자 하는 대로 깨끗이 분리할 수 있는데(그래야 전개 용매를 흘릴 때 띠가 일정하게 내려온다.) Sea sand를 깔지 않으면 띠가 일정하게 내려오지 않아 실험값에 오차가 발생할 확률이 생긴다는 것을 알게 되었다.

 

9) 용매가 50mL 정도 모이면 TLC를 이용하여 시료가 용출되는지 확인한다.

 

10) 시료가 용출되기 시작하면 새로운 용기에 용액을 담고, TLC를 이용하여 시료의 존재 유무를 지속적으로 확인한다. -> 시료가 검출되지 않을 때까지 반복해야 높은 수득률을 얻을 수 있다는 것을 알게 되었다.

 

11) 1차 물질의 용출이 완료되면 다른 용기에 전개 용매를 받으면서 8번 과정을 반복하여 2차 물질을 받는다. (전개 용매 변경 가능)

 

12) 용매를 제거한 후 건조시켜 분리된 물질의 양을 측정하고 HPLC를 통하여 순도를 확인한다.

 

 

■ 실험 결과

---

시간에 따라 검출된 시약의 모습. 농도가 모두 다르다.

검출된 Ortho-Isomer들. 거의 비슷한 Rf값을 가진다.

크로마토그램 결과

적분 결과

 

우리 조는 이번 컬럼 크로마토그래피 실험에서 순도 97.58%에 해당하는 Ortho-Isomer을 얻을 수 있었다. 다른 조에 비해 불순물의 수는 적었으나, 순도의 측면에서 상대적으로 작은 값을 얻게 되었다.

 

다음은 7개 각각의 비커에 담긴 용액에 대한 Rf값으로써, 매우 비슷한 Rf값이 나왔음을 알 수 있다. 이론적으로 1~6번의 Rf값은 모두 같아야 한다. MC:Hexane(3:1) 이라는 전개 용매를 실험을 마칠 때까지 비율을 바꾸지 않고 계속 사용했기 때문이다.

실험은 7번 값처럼 더 이상 Ortho-Isomer가 검출되지 않을 때까지 계속되었다. 이는 높은 수득률을 구하기 위함이었다.

 

 

■ 고찰

---

우선 우리 조는 다른 조들과 비교해 보았을 때 상대적으로 작은 순도의 Ortho-Isomer 값(97.58%)을 얻게 되었다. 그 이유에는 2가지가 있을 수 있다. 첫 번 째로, Sea sand를 1cm정도 깔고 위에 전개 용매를 넣을 때, 숟가락이나 유리 막대를 이용하여 천천히 흘려 내려 보내야 띠가 깨지지 않고 일자로 내려와 실험 값에 오차가 생기지 않는데, 그것을 잠시 간과하고 숟가락을 사용하지 않고 전개 용매를 흘려 내려 보내는 바람에 크로마토그래피 층이 살짝 무너져 버렸다. 그 이유로 불순물이 섞일 가능성이 생기게 되었고, 낮은 순도를 얻게 되는 사태가 발생했다.

 

두 번 째 이유는, 실험이 끝나고 얻은 Nitrophenol의 Ortho-Isomer의 수득률을 구할 때, 플라스틱에 쏟고 남은 Nitrophenol을 MC로 헹구어 마저 넣었는데, MC는 플라스틱을 녹이는 성질을 가지고 있기 때문에 목요일 조원의 대다수가 플라스틱이 뚫리고 말았다. 그래서 수득률을 구할 수 없었다. 레포트를 쓰던 중 문득 순도와 수득률의 차이가 궁금해져 간략하게 조사해 보았다. 왜 순도는 구할 수 있지만 수득률은 구할 수 없었을까? 다음은 순도와 수득률의 정의이다.

 

순도 : 물질이 화학적으로 얼마만큼 순수한가를 나타내는 정도로, 높을수록 물질은 그 물리적 성질이 일정하다.

수득률 : 원료 물질로부터 어떤 화학적 과정을 거쳐 목적 물질을 얻는 경우에 실제로 얻은 양의 이론 양에 대한 비율을 말한다. 수율이라고도 한다.

 

즉, 수득률은 실제로 얻은 양의 이론 양에 대한 비율을 말하므로 검출된 총 시료의 양이 얼마인지 알아야 한다. 그러나 플라스틱이 뚫려 총 시료의 양을 구할 수 없었기 때문에 수득률을 구할 수 없었던 반면, 순도는 물질의 순수한 정도를 뜻하므로 총 시료의 양을 알지 못하더라도 구할 수 있다는 것을 알게 되었다.

 

우리가 실험을 통해 얻을 수 있었던 것은 Nitrophenol의 Ortho-Isomer였다. Nitrophenol의 Para-Isomer는 극성을 띄고, Ortho-Isomer는 상대적으로 덜 극성을 띈다. 우리가 처음에 넣었던 Silica gel slurry는 극성 물질이므로, Ortho-Isomer 보다 Para-Isomer와 더 친하다. 그렇기 때문에 Para-Isomer은 검출되지 않는 것이다. 이번 실험을 통해 새롭게 알게 된 사실이 있는데, 전개 용매를 혼합할 때 극성 용매의 비율을 많이 쓰냐 비극성 용매의 비율을 많이 쓰냐는 실험 속도에 관련이 있다는 사실이다. 전개 용매의 극성이 높아지면 극성 물질인 Silica gel과 반응성이 더 강해진다. 그렇게 되면 시료와 실리카겔의 반응성은 떨어지게 되는 것이다.